常识细胞培养技术

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取小鼠腹腔巨噬细胞与乳胶颗粒在不同培养条件下混合后定量加入24孔板，37℃，5%CO2培养箱中孵育后，荧光显微镜下计数吞噬百分率和吞噬指数。


材料与仪器
试剂、试剂盒双抗1640培养基小牛血清台盼兰
仪器、耗材手术器械CO2培养箱一次性注器96孔板眼科镊眼科剪


步骤
一、验步骤
1如果采用刺激物，则可在验前天腹腔注3%巯基乙醇酸钠每只2mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

2拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消腹部肌层。

3用注器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管道吸取细胞悬液，移入离心管道中(个人认为，此法比用注器抽吸好一些)。

41000rpm离心5min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

5如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个mL，接种到96孔板中，每孔100-200μL；如果作为其它验使用，可以调整成2x106mL，加到24孔平底培养板中，1mL孔；5%CO2温箱孵育2h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。二、结果
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。


注意事项
1严格菌操作，在超净台内进行；
2为避免交叉感染，每一只小鼠更换注器；
3吸管道吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。


常见问题
巨噬细胞一般没有特殊的鉴定方法，有两条经验：
1巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖
2很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。

来源：丁香验